· 没有细胞悬液制备的经验？不知道如何开始？

· 不知道什么样的细胞悬液才能满足建库要求？

· 不知道如何进行实验条件优化？

· 不知道在制备细胞悬液的过程中有什么要注意的事项，避开什么坑？

第一步：从官网查看10x Genomics单细胞悬液制备官方建议

第二步：利用关键词查询与自己样本类型相同的已发表的单细胞测序文献

第三步：参考知名protocol分享网站，选择适合自己的protocol

第四步：选用单细胞悬液制备或细胞分选的商业试剂盒

第五步：参考悬液制备和质控中的注意事项

Cell surface protein labeling for single cell RNA sequencing protocols

Dissociation of mouse embryonic neural tissue for single cell RNA sequencing

Enrichment of CD3+ T Cell from dissociated tissues for single cell RNA sequencing and immune repertoire profiling

Fresh frozen human peripheral blood mononuclear cells for single cell RNA sequencing

Fresh frozen human-mouse cell line mixtures for single cell RNA sequencing

Isolation of nuclei for single cell RNA sequencing

Moss protoplast suspension for single cell RNA sequencing

Removal of Dead cells from single cell suspensions for single cell RNA sequencing

Single cell gene expression demonstrated protocol compatibility table

Single cell protocols-cell preparation guide

Single cell suspensions from cultured cell lines for single cell RNA sequencing

Tumor dissociation for single cell RNA sequencing

1.首先，建议采用无菌样品处理方式，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。

2.为减少对细胞的损伤，移液和离心应保持在最低程度。在给定的离心速度、时间和温度下，细胞浓度和大小直接影响制备的效率。紧密堆积的细胞沉淀可能需要额外的操作，但可能也因此会通过剪切效应损害细胞。当然，在这个时候就需要调整离心条件。

3.此外，在进行细胞清洗和重悬过程中，使用具有足够容积的器皿也可避免高浓度导致细胞集聚和结块。

1.实体组织需要在一开始进行机械分离或酶消化处理。首先，组织需要通过物理切割或刀片切碎，然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间需要仔细选择。

2.样本准备过程可能会引起细胞中基因表达模式的改变，特别是一些胁迫相关基因的激活。此外，一些敏感的细胞亚型可能在此过程中受到伤害。所以，样本准备过程越短越好。相反，如果消化时间太短，可能导致细胞分离不完全，需要在后续单细胞分析过程中排除掉这些紧密相连的细胞。

3.在细胞解离的过程中加入DNase I可以防止细胞团块的形成。

1.在拿到一个心仪的protocol后，如果在这之前没有对自己的细胞解离过，那么一定要先进行一下预实验，优化实验条件，得到一个真正适合样本、能够达到建库标准的protocol。在进行预实验的时候，需要考虑到的因素包括样本组织类型、样本来源、是否进行过基因编辑、解离时使用的培养基、选用何种酶、酶的浓度、解离时候的温度和解离时间等。这些都需要提前确认好，这样才能在真正建库时有十分的把握。

2.新鲜的组织最好可以立即解离，比如刚刚下手术的组织。如果太长时间没有解离完成的话，细胞会出现死亡，进而大大降低细胞活性，影响建库效率。如果需要对组织进行保存的话，我们建议将拿到的组织立即放进组织保存液当中，然后放到4℃保存。从拿到组织到最终解离完成，最好不要超过36小时。

3.根据细胞直径大小的不同，需要离心的时间和速度也是不同的。一般来说，直径较大的细胞选用室温150rcf离心3min，直径较小的选用300rcf离心5min。

4.最好可以使用宽枪头重悬，从而减少细胞损伤。窄枪头剧烈的重悬会显著影响细胞活性，同时让细胞破裂，释放RNA。释放的RNA在Illumina上机扩增放大时会影响数据。

5.建议使用含有0.04% BSA (bovine serum albumin)(400 μg/ml)的 1x PBS 溶液 (无 Ca²⁺、Mg²⁺) 重悬细胞。BSA的作用是防止细胞结团，若细胞结团可适当提升BSA浓度，但最高不超过2%。

6.原代细胞和干细胞这种比较敏感的细胞类型可能需要额外的溶液或培养基。已确定以下溶液对人 293T/17和小鼠 NIH/3T3细胞系的10x单细胞操作无影响：

Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)

如果在上述溶液中不能维持细胞活力，可以用常见的细胞培养基洗涤重悬细胞。以下培养基已确定对人293T/17和小鼠NIH/3T3细胞系的10x单细胞操作无影响：

Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) + 10% FBS

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS

Iscove's Modified Eagle Medium (IMEM) + 10% FBS

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% FBS

Ham's F12 + 10% FBS

1:1 DME M/F12 +10% FBS

M199

7.细胞计数需要设置2个重复，每个样本计数2次，共计数4次。第一次悬液混匀后计数，第二次是再混匀后再计数。

8.另一个需要考虑的因素是不同类型的细胞在RNA含量上相距甚远，而准确测定此参数将影响一些关键决定，比如文库制备过程中的PCR循环数。举个例子，人外周血单核细胞(PBMC)的RNA含量极低，只有0.75 pg/细胞，而HCC38细胞系则富含RNA，含量达到21.6 pg/细胞。

1.制备悬液时间最好不超过4h。

2.单细胞的悬液中不能含有Ca2+和Mg2+，且不能含有诸如Tween 80之类的表面活性剂，否则会影响细胞活性。

3.视情况选择合适尺寸的细胞筛。细胞尺寸可选20~40μm不等，，目的是滤掉杂质和细胞团。

4.推荐细胞活率为90%以上，低于80%不能上机。

5.细胞悬液的最适浓度：700~1200cells/μL。浓度过高，上样体积太小，误差太大；浓度太低，体积太大，会带入一些杂质和细胞团等。

6.细胞悬液制备完成后要尽快建库，样本制备好到上机的时间间隔不宜超30min。不能保证同时制备多个样本的细胞悬液时，可能导致各样本之间悬液制备间隔时间过长，此时则不建议一次完成多样本建库。

7.最佳上样体积为2.5~15μL，建议上样前根据需要上样的细胞数调整单细胞悬液浓度。