为了将 16S 扩增测序的高性价比发挥到极致，建立起微生物基因组学与其他组学，尤其是代谢组研究的桥梁，阅微基因将把原本属于 16S 扩增子测序高级分析的 PICRUSt 功能预测归为常规分析，也就是说，还是一样的测序价格，您就能享受到原本需要额外加费用的高级分析。

当然，费用省了是一方面，更重要的是，通过 PICRUSt 功能预测，可以对 16S 测序数据直接进行功能与代谢通路预测，无缝对接后续代谢组学分析。（关于微生物基因组和代谢组学的联用分析，可回顾《代谢组学+微生物组的「联用」与「联合分析」》、《微生物联合代谢组检测评价中草药对肠道微生物的影响》）
 

PICRUSt 工具全称是 Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States。此工具基于已测细菌 16S rDNA 的信息和对比 Greengene 数据库后近缘物种的 OTU 信息，推断它们的共同祖先的基因功能谱，同时对 Greengenes 数据库中其它未测物种的基因功能谱进行推断，构建古生菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱；最后，将测序得到的菌群组成「映射」到数据库中，继而对菌群代谢功能进行预测。

PICRUSt 功能预测简单来说可以分为以下四步：

1. 对测序已得 OTU 格进行「封闭式」聚类划分，寻找近缘物种，并调用聚类完成后的完整 OTU 表格；

2. 标准化 OTU 表格 (根据近缘物种的 16S rRNA 拷贝数进行校正)；

3. 根据对应的近缘物种功能基因数 counts，结合预测标准化 OTUs counts 进行计算，最终得到样本和其功能基因的表格；

● 非常靠谱；PIRCUSt 功能预测的准确性达到 85%

用 16S 测序数据就能进行功能预测？很多老师最关心的就是这个方法靠谱吗？准确率怎么样？

2013 年当 PICRUSt 算法发表时，开发者做了大量的研究和验证。令人欣喜的是，利用 PICRUSt 算法基于 16S rDNA 预测到的菌种基因组结果与真实的菌种参考基因组图谱非常接近，古菌预测准确度为 94%±4%，验证样本为 103 个；细菌预测准确度为 95%±5%，验证样本为 2487 个。如下图所示：
 

B. 与不同样本类型（肠道、口腔、皮肤等）宏基因组测序结果进行聚类对比，PICRUSt 功能预测与宏基因组结果差异不大，聚类效果好^[1]

PICRUSt 虽然有着很好的预测准确率，但也存在着局限性。对于在 Greengenes 数据库里没有同源参考基因组序列的物种是无法被预测的；且只能对细菌和古生菌做功能预测，无法对真菌进行功能预测。

除此之外，PICRUSt 对于不同样本类型的微生物，其预测效果是不一样的。对人类或者哺乳动物的微生物预测效果最好, 对参考微生物基因组不全的样本类型，例如土壤和盐碱地，预测效果就会下降。

最后，PICRUSt 虽然有着较好的准确性，但是不能完全替代宏基因组测序，因为只是「预测」，并不是样本中实际的基因。
 

PICRUSt 方法于 2013 年 9 月发表在《Nature Biotechnology 》杂志上，引用该文献的 SCI 文章也呈现逐年递增的趋势，总引用次数 1640 次，在刚刚过去的 2018 年，被引用次数高达 633 次，其中不乏《Cell 》、《Nature 》和《Science 》等顶级期刊。

高引用次数一方面证明了 PICRUSt 方法是可靠、实用和被认可的，另一方面更是因为多组学研究（尤其是代谢组学）的兴起。常规的 16S 扩增子测序分析只能得到物种组成和多样性的结果，如果要进行多组学关联分析，则要使用宏基因组测序。而 PICRUSt 让 16S 测序结果也可以进行功能预测，规避了宏基因组测序的高费用，把 16S 的性价比发挥到极致，搭建起了微生物基因组学和多组学的桥梁。

● 除了 PICRUSt 之外，还有哪些功能预测的工具？
 

上表总结出了目前微生物领域的功能预测软件，PICRUSt 推出的最早，也有着最多的引用次数，最受科研人员认可和喜欢。但随着大家对古菌、真菌等多种非细菌群体的关注和注释数据库的更迭，也不断有其他新的算法推出。

值得注意的是，上述方法都仅起到了功能预测作用，不能完全替代研究样本真实菌落结构和基因的宏基因组测序。同时，功能预测是一个连接多组学的桥梁，因此预测得出的功能线索还要结合宏基因组学、代谢组学、蛋白组学和转录组学共同进行验证。

参考文献：

[1] Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, et al. (2013) Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA markergene sequences. Nature Biotechnology.  DOI：10.1038/nbt.2676