微生物联合代谢组检测评价中草药对肠道微生物的影响
【2018-12-10】
肠道微生物的组成和变化会影响人体健康的理论已经获得了共识。一些药物的使用会改变肠道微生物的群落结构，从而改变人体的生理条件。例如，抗生素的使用显著影响肠道微生物组成，从而影响人体稳态，可能引起胃肠道副作用或影响其他药物疗效。
中草药治疗是一门临床实证医学，但其药理和安全性也颇受质疑。在进行药物评估时，药物对肠道微生物的影响就是一个很重要的指标。随着微生物测序技术和代谢组检测技术的发展，科学家们能够用更先进和科学的手段探究中草药对人体肠道微生物的影响，从这个角度去阐述中草药对人体健康、疾病治疗等方面的作用。
已有诸多研究表明：使用草药可以特定地改变肠道中丰度较高的菌群结构，例如拟杆菌门、厚壁菌门、AKK菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、普氏菌属等，这些微生物组成的改变会对很多代谢通路产生影响，例如脂肪酸代谢、糖类代谢、脂质代谢等。探究清楚其中的机制，对中草药的评估、使用和发展都有着重要意义。
本次大阅哥将用三个具体的案例来讲解如何利用微生物组学联合代谢组学检测的方法评价中草药对肠道微生物的影响并阐述其中的机制。
案例一：利用16S测序+宏基因组学探究黄连解毒汤改善高血糖和胰岛素抵抗中肠道微生物调节的机制
Chen, M., et al. (2018). Huang-Lian-Jie-Du-Decoction ameliorates hyperglycemia and insulin resistant in association with gut microbiota modulation. Frontiers in Microbiology. (IF：4.019)
药物：黄连解毒汤
实验模型：大鼠粪样
实验组设计：对照组(NCG)、模型组(DMG)、治疗组(HLJDD)
生物重复数：8
主要研究方法：16S、宏基因组(功能预测的基因验证)
主要分析手段：LeFSe、PICRUSt
结论：黄连解毒汤可改善高血糖，恢复失调的微生物结构和功能
黄连解毒汤(HLJDD)是一种中药方剂，临床应用已有数千年的历史，其作用机制已被报道与肠道微生物有关。然而，还没有研究发现HLJDD对2型糖尿病(T2DM)患者肠道微生物的影响。本文探讨HLJDD对T2DM患者肠道微生物群的调节作用，以及菌群调节对疾病治疗的可能机制。
首先，采用16S测序法对正常对照组(NCG)、T2DM模型组(DMG)和HLJDD处理的2型糖尿病组(HLJDD)的大鼠粪便标本中的细菌群落进行分析, 并用PICRUSt工具预测其差异菌种功能。
图1 差异菌种预测
A. 三组实验显著差异菌种LefSe B.门水平上物种组成比例与丰度(三个处理条件所有样本)
C. 门水平上物种组成比例与丰度(不同处理条件下的实验分组)
结果显示：HLJDD能明显改善T2DM大鼠的高血糖和炎症反应，恢复T2DM大鼠失调的肠道系统；与DMG组相比，HLJDD组具有更多的短链脂肪酸和抗炎细菌产生，如Adlercreutzia、副杆状菌属(Parabacteroides)、Blautia 和 Akkemansia菌属等；与此同时，HLJDD组比DMG组产生更少的条件性致病菌，如葡萄球菌属(Staphylococcus)、气球菌属(Aerococcus)和Facklamia菌属等。
功能预测显示，氨基酸代谢功能在DMG组显著富集，而治疗后，HLJDD组胆汁酸生物合成的代谢上调且糖酵解/糖异生和核苷酸代谢减少，更偏向于正常对照组，证实大鼠肠道微生物的功能失调有所恢复。
图2 不同实验组基于PICRUSt预测菌种功能的ANOVA分析
由于PICRUSt功能预测只是基于16S DNA片段进行的，随后研究者又用宏基因组的方法验证了上述基于16S扩增子测序得出的功能预测。宏基因组结论显示：这种作用主要通过增加了产短链脂肪酸与抗炎症的细菌和减少机会致病菌实现。这与16S DNA片段的研究结论一致。
此篇文章由中山大学谢智勇老师团队发表。首先进行16S测序，并基于16S测序结果用PICRUSt进行功能和代谢通路分析，接着用shotgun宏基因组测序验证预测得出的功能和通路，是一个不错的思路。大阅哥想补充一点，既然通路涉及到脂肪酸、胆汁酸和氨基酸等代谢变化，倘若再用靶向代谢组检测进一步验证，文章将更加完善。
案例二：利用16S测序、GC-MS代谢组检测等方法探究甘草-甘遂结合对肠道微生物与其功能的影响研究
Yu, J., et al. (2018). Gancao-Gansui combination impacts gut microbiota diversity and related metabolic functions. Journal of ethnopharmacology. (IF：3.115)
药物：甘草、甘遂、甘草-甘遂混合使用
实验模型：小鼠粪样
实验组设计：对照组(control)、7天连续服用甘草(GUH)、服用甘遂(EBH)或服用甘草甘遂组合(GEH)
生物重复数：6
主要研究方法：16S、GC-MS
主要分析手段：PCoA 、LeFSe、PICRUSt
结论：甘草-甘遂的结合使用会对肠道微生物的结构和其对应的功能造成不良影响，需要更进一步的研究揭示更深机制
“十八不兼容的药物”理论(EIM)是中国传统医学(中医)具代表性的中药相互作用理论。甘草和甘遂的不兼容就是EIM理论之一。甘草,是常用的中药或食品添加剂；甘遂是另一个有名的中药，通常用于治疗水肿、腹水和哮喘,但可能诱发胃肠道副作用或呼吸道过敏。尽管甘草和甘遂是不兼容的,但他们仍然在“甘遂-半夏汤(Gansui-Banxia)”中配合使用。
图3 文章研究思路流程图
本研究中探究甘草甘遂联用是否会加剧由甘遂诱发的胃肠道损伤。此外,也对甘草甘遂联用所影响到肠道微生物菌群结构及相关代谢通路进行了评估、检测和验证。
实验所有小鼠模型被分成四组：对照组、7天连续服用甘草(GUH)、服用甘遂(EBH)或服用甘草甘遂组合(GEH)。
图4 四个实验组的PCoA分析
A.binary Jaccard距离 B.weighted UniFrac距离
首先，血清生物标志物检测结果显示GEH并没有加剧EBH引发的胃肠道损伤。接着，对四组小鼠粪便进行16S扩增子测序，PCoA分析结果显示，与对照组相比，GEH比EBH破坏了更多的肠道微生物环境，而GUH没有显著破坏；LefSe分析显示EBH会导致Mycoplasma和Desulfovibrio菌属(机会致病菌)的增加和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)减少。
图5 三组处理与对照组相比差异菌种LefSe分析
继续用PICRUSt工具对16S测序数据进行功能和代谢通路预测，结果显示，GEH组的碳固定、能量代谢、氨基酸代谢和醌类合成代谢途径相对减弱，而酸转移酶系统、磷酸戊糖途径和脂类代谢通路相对升高，而这些变化主要来自于Mycoplasma菌属丰度的改变。
图6 基于GC-MS平台脂质代谢组的检测结果-胆固醇相对丰度
为了验证微生物测序得出的代谢通路变化的结论，考虑到Mycoplasma菌属在脂质代谢方面的主要作用，研究者用GC-MS(气相色谱-质谱)来分析小鼠粪便中的脂质代谢情况。检测后共鉴定出三种代谢产物，分别是胆固醇、丁羟甲苯和岩芹酸。结果显示GEH组胆固醇丰度最高，而GUH和EBH组胆固醇丰度没有显著差异。结合微生物测序结果得出结论，肠道微生物的胆固醇代谢途径因为GEH的食用失调，而这应是由于Mycoplasma 属的高丰度导致的。
此篇文章出自南京中医药大学郭建明和陶伟伟老师课题组，研究了中草药相互作用对肠道微生物的影响。本研究是探究单一中草药对肠道微生物影响的另一种研究思路，值得学习。先利用16S测序、PICRUSt功能预测的方法，找到了差异菌种和代谢通路；从中选出显著差异脂质代谢通路，并用GC-MS方法验证了其代谢产物的差异，最终得出结论，是一篇经典的微生物组测序联合靶向代谢组分析的案例。
案例三：利用LC-MS平台和16S测序研究柳树皮提取物与肠道细菌之间的相互作用
Pferschy-Wenzig, et al (2017). A Combined LC-MS Metabolomics-and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in pharmacology, 8, 893.(IF：4.4)
药物：柳树皮提取物
实验模型：人粪便厌氧发酵培养
实验组设计：柳树皮提取物浓度2mg/ml与10mg/ml，培养时间0.5h、4h与24h，样本处理分为PMA(在提取DNA之前用PMA处理，以区分死菌和活菌)和DNA两组。三个因素排列组合
生物重复数：2
主要研究方法：16S测序、LC-MS
主要分析手段：PCA、PCoA、LeFSe、PICRUSt
结论：利用in vitro培养的方法知晓了柳树皮提取物中的化学物质和被柳树皮处理过后的肠道微生物的组成和功能变化
柳树皮提取物(WBE)是一个沿用千年的中药材，具有抗炎、镇痛和解热的作用。但是由于其成分复杂，至今还不能很好地解释其疗效与机理。本文利用16S测序结合代谢LC-MS检测的方法研究了WBE与肠道微生物的相互作用。
图7 16S测序后不同处理样本的差异微生物
绿色代表与对照组相比上升，红色代表下降(图表部分节选)
研究首先将取于健康人的粪便与不同浓度的柳树皮提取物在厌氧条件下分别共同培养0.5、4和24 小时。并对所有不同条件处理的样本进行16S测序，测序结果显示与柳树皮提取物一起培养的粪便中的肠道微生物结构有较大变化，如食物谷菌科(Victivallaceae)、拟杆菌属(Bacteroides) 和红蝽菌科(Coriobacteriaceae)等菌种丰度显著上升，而瘤胃菌科(Ruminococcaceae)，特别是Faecalibacterium prausnitzii菌显著被抑制。
图8 基于16S测序数据功能预测差异代谢通路(图表部分节选)
通过PICRUSt工具对16S测序数据进行功能预测，得出共51条代谢通路在实验组和对照组中有明显的差别，特别的是, 拟杆菌属微生物参与的复杂碳水化合物和苷类化合物的降解明显在柳树皮提取物处理过的粪样中富集。
图9 基于LC-MS平台检测差异代谢产物(图表部分节选)
接着用LC-MS平台检测不同实验组情况，共有58种显著上升或者下降的代谢产物被注释出，这些代谢产物在未与WBE共培养的粪样中是不存在的，说明这些是柳树皮提取物的成分或者其代谢产物。检测出的代谢物包括丰度较高的水杨醇衍生物、类黄酮、儿茶素，少量的脂肪族、芳香族酸和芳香醇等物质。
最终比对结果显示Bacteroides在WBE处理后显著上升，其中B. uniformis 和 P. distasonis 被报道可以分解类黄酮类化合物，而代谢组检测到了黄酮甙类，这些菌可能在该代谢通路上发挥作用。而在WBS处理后上升的食物谷菌科 (Victivallaceae)可能和糖酵解代谢通路有对应关系。
此篇文章出自澳大利亚犹他大学。本文是在体外研究草药对肠道微生物影响的一个案例，这种方法非常适合因中药成分不明确无法在人体上实验，而又不使用动物模型的场景。研究者利用16S测序和PICRUSt工具进行功能预测，挑选出差异的代谢通路，结合LC-MS广筛检测分析；最终得出部分显著差异菌种和其所对应代谢产物的关系。本研究是微生物测序和LC-MS平台联用的经典案例，值得借鉴。
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