10x Genomics单细胞测序，告诉您为什么选阅微基因（附详细QA）
【2019-08-01】
你可能想知道：
1. 10x 单细胞测序为什么要选阅微基因，有什么“过人之处”？2. 10x 系统是如何捕获、分选细胞与完成建库的？3. 在收样和制备样本时需注意什么？4. 单细胞测序对于细胞数量有什么要求？该如何计算？5. 如何制备出合格的单细胞测序悬液样本？
高通量测序技术的迅速发展为生物研究带来了前所未有的机遇，但传统的Bulk测序手段是针对细胞集合进行测序，而单个细胞特异性的信息往往被掩盖，导致错失很多重要信息。10x Genomics单细胞测序在单个细胞水平进行高通量测序，其能够以单细胞分辨率进行基因表达谱测序、染色质易开放区域测序(ATAC-seq)、V(D)J免疫组库测序和基因组测序等，越来越受研究者的青睐。
单细胞测序适用于绝大部分的细胞类型，包括生殖细胞、胚胎细胞、血细胞、神经细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞等。同时单细胞测序的应用领域十分广泛，其中发育生物学领域的研究最多，例如脑发育研究、胚胎细胞发育研究等；肿瘤、免疫、神经科学等也有非常多高水平的研究相继出现。目前在这些领域的研究工作主要集中在大规模细胞图谱构建、差异表达基因分析、肿瘤异质性分析等。
DOI：10.1038/s41586-019-1373-2
7月11号，《Nature》刚刚发表重磅研究成果，报道了来自德国和法国的团队利用单细胞转录组测序成功对来自9个人类供体的近10,400个单细胞进行了分析，创建的细胞图谱涵盖了所有重要的肝脏细胞类型，包括肝细胞、肝脏主要代谢细胞、血管内皮细胞、肝脏巨噬细胞以及其他免疫细胞类型。
相信在未来，这些领域当中的研究工作如发育生物学中的亚群细化和稀有细胞类型鉴定、肿瘤研究当中的致病靶标鉴定、治疗前后差异等研究会更加细化、深入。
10x 单细胞测序，
阅微基因有何 “过人之处” ？
理由一：精益求精，让您放心
10x Genomics 单细胞转录组测序技术流程
在第一步细胞悬液制备和最后一步数据分析等人为操作环节上，我们做到专业极致、精益求精：
· 严格控制细胞活性、大小、浓度——准确计算上机细胞量
Chromium芯片的每个孔可捕获检测到100~10,000个细胞，细胞捕获效率65%，最大上样体积不能超过46.6uL。为了获得单细胞反应体系，细胞悬液浓度建议控制在700~1200细胞/uL，且细胞活性和细胞大小均会影响到上机过程和最终结果。阅微基因根据10x Genomics特点,按照客户需求严格计算细胞上机量，严控细胞活性。力求保证客户数据的饱满度、准确度和预期性。
· 确保数据分析全面，免费赠送修改次数
阅微基因提供全面的10x单细胞数据分析服务
单细胞转录组测序分析流程
如果您对分析结果不满意，或者有其他需求，没关系，我们还在售后服务中提供1次免费修改,免除您的后顾之忧。
理由二：灵活服务，让您省心
· 除了快速上门服务，我们还提供寄送样本的制备服务
当您制备好合格的单细胞悬液之后，阅微基因将为您提供快速、及时的上门捕获建库服务，最快当日达。让您免除错过最佳捕获时间的忧虑。如果您的实验室不具备制备细胞悬液的条件，我们也可以帮您制备样本细胞悬液、优化实验条件，以确保可以符合上机条件。我们选用10x 官网推荐的样本制备商业化平台——Miltenyi Biotic（美天旎），并对多种组织类型的处理流程进行了优化。已经处理过的组织类型包括：人口腔组织、肠组织、甲状腺组织、乳腺组织、肾组织、肝脏组织、心包积液、小鼠皮肤组织、脑组织、睾丸组织和肺组织等30余种组织类型，积累了丰富的经验。您只需将样本在适宜保存条件下寄送至阅微基因即可，解决您的后顾之忧！
理由三：贴心管家，让您暖心
· 打包最新最全单细胞测序文献，让您紧跟科研动态
我们贴心地帮您总结了超150篇最新最全的10x单细胞测序相关文献，并按照研究方向归类（包括发育生物学、肿瘤、免疫、神经科学、空间转录组和生殖生物学等），各个研究领域文章平均影响因子（IF）在20左右。
· 一对一管家式技术服务，后续报告解读无忧
对接人老是换？需求传来传去回复慢？技术不专业？对此，阅微基因通过采用一对一管家式服务来解决。一旦确认您的需求，我们会安排经验超3年的专业技术管家和您一对一对接，确保您的需求尽快实现。同时，在完成测序后，我们还提供免费的报告解读一站式服务。
理由四：完善服务，让您舒心
· 单细胞测序体系完善——转录组、ATAC和免疫组库
阅微基因提供完善的单细胞测序服务，包括最常应用的单细胞转录组测序（scRNA-seq）、单细胞ATAC测序与免疫组库测序。针对不同实验需求，阅微基因具有完善的建库、测序和数据分析策略，全方位助力您的科研。
· 不止单细胞测序，全面的服务助力您的各类研究
凡是通过本文在8月1日-8月31日期间进行单细胞测序的老师，选择以上任意服务直接享受8折优惠。
附：常见10x单细胞测序QA
Q1.10x 系统是如何捕获、分选细胞与完成建库的？
当制备好合格的细胞悬液之后，细胞的捕获、分选和建库都是在10x平台上的芯片上进行的。每个芯片上面有8个孔，每个孔可以上一份样本，且最大上样体积不能超过46.6uL，每份样本可捕获检测到100~10,000个细胞，捕获效率约为65%。因此如果要检测到10000个细胞，初始就要上16000个细胞。
但值得注意的是，随着上样体积和细胞数的增加，多细胞GEM形成率会增加。虽然可以从后期的生物信息学分析中剔除，但是会占用测序量。为了获得单细胞反应体系，细胞悬液浓度建议控制在700~1200细胞/uL，因此产生的90~99% GEM不含有细胞，剩下的大部分GEMs（含有Barcode的Gel beads和细胞、反应试剂的混合物）含有单个细胞。
Q2. 在收样和制备样本时需注意什么？
· 样本类型：细胞（植物细胞需制成原生质体）、组织（一般需要鲜样不可冷冻）、血液· 样品总量：细胞悬浮液样本细胞起始量约 1x105个（指制备成单细胞悬液时最初的量，活性，裂红，镜检）· 细胞活性：活细胞数大于90%（一般要求85%以上）。细胞上样前通过染色和显微镜观察活细胞数量，可选择使用特定方法去除死细胞（若采用磁珠法细胞活力可提升25~40%）· 最适上机浓度：700~1200 cells/µL· 细胞大小：小于40μm，几乎涵盖各种动物细胞类型（大于40μm的细胞需制备成细胞核，但可能会丢失更多信息）· 细胞培养基及缓冲液不能含有 Ca2+和 Mg2+等影响酶活性的物质（需要用无离子的PBS进行洗涤）
Q3. 单细胞测序对于细胞数量有什么要求？该如何计算？
在单细胞转录组测序前期实验设计中，首先需要确定测序细胞数，在已发表的10x单细胞转录组文章中，不同文章的测序细胞数差异很大，从几千个到几万个都有可能。测序细胞数直接影响着细胞聚类结果的好坏，而细胞聚类又是分析工作中最基础且重要的环节。因此，确定细胞数量是重中之重。如果要做细胞图谱，一定要保证细胞量。一般建议做20000个细胞，或者预先做分选。
如果要讨论不同亚型细胞的功能、发育和分化和能否得到精确的细胞亚型，则需要进行细胞数量的计算。主要有两种计算方法：
方法1：
依照粗略的计算公式，计算测序所需细胞量。计算公式为：
P(d)= 1-(1-s)nP(d)：检出力s：目标细胞亚群比例（一般为最小比例细胞亚群，也称为罕见亚群）n：需要被测序的细胞数量
此公式换算后为：n=lg (1- P(d))/lg(1-s)
依照此公式，当组织中或者细胞悬液中目的细胞亚群比例为1%，检出力达到0.9时，需要250个细胞被测序。当目的细胞亚群比例为1%，检出力达到1时，则需要500个细胞被测序。需要注意的是，这种粗略计算方法没有考虑到降低假阳性和假阴性错误率，以及消除随机误差所需要的细胞重复数，一般所需的细胞重复为2~5次重复。
方法2：
第二种细胞测序数量估算方法和第一种估算方法相比，除了考虑最小频率细胞亚群、检出力，还考虑了可能的细胞亚群数量和最小频率细胞的最低细胞检出量。例如当所有细胞可聚类成10个亚群，最小比例细胞亚群比例为3%（0.03），检出力达到90%且最小比例细胞亚群至少有50个细胞被检测到，需要的测序细胞量是2200个细胞。针对此算法，Satija 实验室已经开发了一个网络工具评估细胞测序数量(https://satijalab.org/howmanycells)，在网站中可以调节参数计算测序细胞数量。
Q4. 如何制备出合格的单细胞测序悬液样本？
制备单细胞悬液时，首先要看样本类型：
针对已经处于悬浮状态的细胞、磁珠富集的细胞或流式分选的细胞，只需要进行清洗和计数，即可用于单细胞转录组或免疫组分析；
但在处理组织类样本时，必须首先通过机械法或酶解法进行解离，为了达到最佳的处理效果，需要对实验方法进行多次优化。
对自己样本非常熟悉的老师可以按照自己的方式处理组织样本，如果不知该如何把组织样本制备成合格的细胞悬液，则建议按照下面建议的5步法走：
第一步：从官网查看10x Genomics单细胞悬液制备官方建议，看是否适用于自己的样本；第二步：利用关键词查询与自己样本类型相同的已发表的单细胞测序高分文献，参考文献当中的单细胞悬液制备方法；第三步：查看一些知名的protocol分享的网站：例如“Protocol.io”和“Cold Spring Harbor Protocols ”等；第四步：目前有一些组织制备单细胞悬液或细胞分选的商业试剂盒，首选10x Genomics官方认证的“Miltenyi 美天旎”品牌，里面有10余种组织消解试剂盒。同时可以去“Worthington”官网上查看组织消解最佳的酶；第五步：参考一些在样本保存、组织样本制备、细胞悬液质控中的注意事项。避免发生错误导致制备出不合格的单细胞悬液。
以上5步详细内容与步骤可咨询阅微基因，同时阅微基因可帮助您制备单细胞悬液，您只需将组织样本寄给我们处理即可，详询4000192196。
Q5. 细胞聚类后，可以知道这些细胞亚型属于什么细胞吗？
我们会对聚类出来的细胞进行细胞定义，通常来说有两种方式：
第一种：基于常用的数据库对比细胞marker，完成细胞的定义，这类定义比较粗略；第二种：需要老师自行提供细胞定义的典型marker，阅微基因将根据这些信息数据完成精细的细胞定义。
细胞定义的常用数据库：CellMarker
